肝脏干细胞

肝脏干细胞是什么

人体胚胎发育早期，前肠末端的肝憩室演化为肝部和尾部两个部分，其中肝部生长极为迅速，至胚5周时已经充填于腹腔大部。这些向肝脏演化的胚胎样肝细胞我们称之为成肝细胞（Hepatoblasts），它不但具有旺盛的增殖能力，而且具有向肝细胞和胆管细胞分化的潜能，所以成肝细胞实际上就是胚胎肝脏干细胞。只有前肠末端在胚胎发育中可以被诱导成成肝细胞。4个转录因子家族在肝细胞特定分化基因的表达中发挥了重要作用：①具有相同结构域的各种肝细胞核因子1（hepatocyte nuclear factor 1,HNF1）；②系列肝细胞核因子3蛋白（HNF3）；③核受体超家族；④亮氨酸拉链家族（C/EBP）。靶细胞在上述转录因子的调控下，通过特定基因的表达而产生表型的改变。

胚胎肝脏干细胞的细胞标志包括分化标志如白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）和系列细胞角蛋白（CK7，8，9，14，18，19，20),相关的干细胞因子和受体如Thy1、Flt3、SCF/ckit、OV6，髓源性干细胞标志如CD34等。Taniguchi等［3］基于上述细胞标志用流式细胞分选法（FACS）成功地对胚胎肝脏干细胞进行了分离培养，分离的胚胎肝脏干细胞向同系动物肝脏移植可以分化成肝细胞和胆管上皮细胞，表明胚胎肝脏干细胞的确具有多向分化潜能。

正常肝脏是否存在干细胞尚有争议。有学者基于成熟肝细胞在肝损伤后可以不间断地恢复增殖能力的特点，提出肝脏本身就是一个“干细胞池”的观点。然而根据干细胞的定义，干细胞除了具备分裂增殖能力以外，还应具备一定的分化潜能。成熟肝细胞分裂产生的后代细胞仍然是成熟肝细胞，因此从严格意义上讲，成熟肝细胞不应被看作是干细胞。

肝脏干细胞的功能

肝脏干细胞能够补充自身细胞群体，并维持了发育为更特化细胞潜能的细胞，它们为随着时间的推移为自然丧失细胞的肝脏提供新细胞。

肝脏干细胞的分化和发育

肝脏肝细胞的分化和发育是一个复杂的过程，如同正常肝细胞再生过程一样，许多生长因子共同作用而影响它的增殖和分化。其中，TGF-a(转移生长因子)，HGF(肝细胞生长因子)，aFGF(纤维母细胞生长因子)，HSS(肝刺激物质)都能诱导原始肝细胞的反应0卜。在AAF／PH模型中，肝切除后，第一个进入DNA合成期的是DV6，desin的胆小管和Ito细胞。伴随这些细胞出现，可观察到TGF-a、HGF表达增强，而aFGF表达在于24h后增强，平时无法检测的TGF-~也可观察到。所有这些生长因子在肝脏肝细胞整个增殖分化过程中，高水平表达。再生结束后回正常水平。而SCF／C-kit具有惟一肝切除后肝早期再生中轻微短暂的激活作用，它与其他因子相互作用来调节干细胞增殖，一旦肝卵圆细胞分化成肝细胞，SCF／C-kit的表达就消失了。

在正常的肝脏，肝脏肝细胞处于休眠期，不发生增殖和分裂。当肝脏肝细胞激活以后，也必须在适宜的微环境中才能分化成熟。Dabeva等将分离的肝脏肝细胞分别植入经retrorsine处理和未经其处理的大鼠体内，在实验组发现植入的肝脏肝细胞分化为肝细胞和胆管细胞，未处理组则没有明显分化细胞。在胚胎后期0，肝内胚肝细胞可分化为小肝细胞，位于门脉区，可进一步分化成胆管细胞。在这个分化过程中，CD45的造血干细胞能诱导胚肝细胞分化，大部分造血干细胞离开肝脏到达骨髓和脾脏，仍有一小部分造血干细胞停留于肝内。但另一方面Hering管细胞表达C-kit拈和(或)CD34，可能是肝内的造血干细胞或循环到肝内的造血干细胞迁移到Hering管分化成肝细胞或胆管细胞。在新生儿时期，大部分肝细胞可能是小肝细胞并促使肝脏生长。这些小肝细胞富含线粒体、粗面内质网、过氧化物酶、糖原，胞浆多，一些细胞产生两个核，随后发生肝组织重建。在严重的肝受损、肝衰竭时，大多数肝细胞死亡和(或)特殊肝毒性处理，肝卵圆细胞迅速增殖、分化成小肝细胞并成熟为肝细胞补充损伤。但当Hering细胞死亡后，肝细胞可由循环中成肝内的造血干细胞分化而来。在啮齿类动物中，肝卵圆细胞还可分化成肠道黏膜吸收细胞、杯状细胞、内分泌细胞和潘氏细胞。

肝脏干细胞分离培养

肝脏肝细胞的分离和培养是研究其生物学特点和细胞分化调控的主要手段，同时也为临床应用提供必要的理论依据。目前诱导肝卵圆细胞激活动物模型中常需：

(1)行2／3PH来引发肝再生。

(2)用D-半乳糖胺(D-GaIN)、四氯化碳(CC1)等造成肝损害。

(3)用各种药物如2一乙酰氨基芴(2一AAF)、dipin、呋喃(furan)、胆碱缺乏一乙硫氨酸饮食(CDE)来阻止肝细胞本身的再生。而分离肝脏肝细胞较多采用荧光活化细胞分类法(FACS)，利用流式细胞技术结合免疫荧光标记单克隆技术来分离。

Suzuki等采用FACS方法从13．5d的小鼠胚肝的CD45一TER119一的细胞中筛选出C-kitCD49f细胞和CD49f+CD29细胞，将其植入小鼠脾脏，可以分化成肝细胞。Yasui等从LEC(1ong-EvansCinnamon)大鼠分离肝脏细胞，用各种酶消化大肝细胞，然后通过Percoll液等密度离心可以获得肝卵圆细胞，经鉴定发现谷氨酰胺转移酶(GGT)、甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白(CK)18及19阳性，白蛋白阴性。另外许多学者致力于肝脏肝细胞培养液的研究，如Brill等的含二甲亚砜激素的限定培养液(建立鼠胚原代肝细胞长期培养方法)和Tateno等的含小牛血清、表皮生长因子、烟酰胺、2一磷酸维生素C及DMSO的培养液(支持肝细胞连续生长却不失去其增殖和分化功能)等，他们为进一步研究体外培养肝脏肝细胞的特点做了有益的尝试。

肝脏干细胞在肝损伤中的运用

肝脏干细胞在肝脏脏修复损伤的过程中具有重要临床意义。一般认为肝脏细胞增生性反应可分为：

(1)代偿性增生或再生。

(2)肝脏细胞过度增生。

(3)干细胞增生。其中肝脏干细胞增生具有特定的临床研究价值。

Gorclon等研究人员在倒千里光碱／PH大鼠模型中，在第3天，可以在肝脏中发现被认为是肝脏干细胞的小肝脏样祖细胞。这些细胞很小，小于肝脏细胞和对照组中再生的肝脏细胞，它们能在肝脏细胞再生受抑制时快速增生、分化、发育成成熟的肝脏细胞来补充肝脏组织的缺损。Alison等。也发现慢性胆汁淤滞的肝脏脏给予CC1／PH处理后，肝脏卵圆细胞增殖，并进入肝脏实质内形成胆小管，新的胆小管表达胆管上皮角蛋白7，8，18，19，还有波形蛋白。可说明在一定条件下，胆管上皮是有效的潜在的肝脏干细胞池。在人类肝脏病肝脏细胞早期，门静脉周围的肝脏细胞具有祖细胞表型，表达OVo，CK7，19和chrom-A，表明肝脏干细胞参与肝脏脏再生。

肝脏干细胞与肝功能的重建  

各种原因所导致的急性和亚急性肝细胞坏死，如果肝脏的基本构架尚存，利用肝脏干细胞无限增殖的特点及其可以向肝细胞和胆管细胞分化的潜力，可望通过人肝脏干细胞移植来救治患者。

肝脏干细胞与肝细胞癌的治疗  

肝癌的发生可能是肝脏干细胞的分化受阻，据此可以通过改善肝脏的微环境来诱导癌细胞向正常细胞分化，或者诱导癌细胞凋亡来达到治疗目的。早在10年前，Coleman报道由大鼠肝脏干细胞系WBF344恶性转化的异倍体肝癌细胞株GN6TF和GP7TB向同系大鼠肝内移植，结果GN6TF未发生肿瘤，癌细胞整合到了肝实质内形成了正常的肝板；而GP7TB在肝内仍有成瘤性，但肿瘤在组织形态上分化良好。其结论是肝组织的微环境可以影响癌细胞的分化，消除或减低肿瘤细胞的恶性潜能。目前已有若干体外诱导肝癌细胞系向成熟肝细胞表型分化的实验报道，但诱导分化的分子机制及临床应用前景尚有待于进一步的研究。

肝脏干细胞在临床上对肝炎病毒的影响

临床研究发现在急、慢性乙型肝炎和丙型肝炎病人肝脏内均可见典型或不典型的胆小管增生，以慢性活动性肝炎出现最多，急性肝炎出现最少。Ma等通过免疫组化在29例慢性肝病病人(包括19例慢性病毒性肝炎)肝脏寻找肝脏肝细胞，发现肝卵圆细胞主要存在于汇管区和纤维隔内，随着肝纤维化程度的加重其细胞数显著增加，特别在肝硬化组织中数量最高。Lowes等“的研究同样证明肝卵圆细胞数与慢性肝病中炎症的严重程度密切相关。Ott等将HBV增强子I和S1启动子序列转染原代肝细胞、HBC-3肝祖细胞、鼠胚干细胞及成纤维细胞，发现HBV序列的转录效果是原代肝细胞最强，鼠胚干细胞及成纤维细胞居中，成纤维细胞未显示其活性。进一步阐述了肝脏细胞的增生与肝炎病毒密切相关，并且可能标志着肝细胞癌变的危险性增加。

肝脏干细胞的应用前景

1.肝脏干细胞基础研究：既然肝癌的发生与肝干细胞密切相关，那么可以通过对动物和人的肝干细胞体内和体外研究，进一步阐明肿瘤的发生机制，希望找到一个揭开肿瘤之谜的途径。此外肝干细胞的分化和发育的研究有助于揭示肝脏的发生、发展、成熟的发育学规律。通过研究肝干细胞分离和培养技术来探讨肝脏生理、病理生理及其可能的调控机制，为临床应用打下理论基础。

2.肝脏干细胞移植研究

目前普遍认为肝干细胞的细胞移植有以下几个方面

（1）利用肝干细胞向肝细胞转化的潜力启动肝再生，以治疗临床肝功能衰竭；

（2）利用肝干细胞潜在的造血功能治疗各种血液病；

（3）针对细胞癌变和致癌作用来研究相应的抑制或阻断剂。

由于肝脏干细胞和造血干细胞有许多相似的特征，可考虑将易获得的造血干细胞代替肝脏干细胞，作为肝细胞移植和人工肝新的干细胞来源。同样可以在体外将肝脏干细胞基因修饰后移植给相应基因缺陷的肝脏，使其转变成正常的肝细胞可用来治疗肝代谢性疾病和病毒性疾病。

日本学者在动物实验中成功分离培养并移植了肝脏干细胞，确定能合成蛋白质、生成新的肝组织，这个小组将实验鼠分离培养出干细胞并增殖。然后，将增殖的数量仅为10万个(占总数1／2000~3000)移于肝功能衰竭的鼠肝中，40d后发现，肝脏干细胞发育成新的肝组织，20%-30%癌变的肝组织被新的肝组织置换，新的肝组织能分泌只有肝脏才能分泌的清蛋白，这表明肝功能开始发挥作用。

肝脏干细胞与基因治疗

基因治疗是遗传缺陷性疾病乃至恶性肿瘤最有前途的治疗方法，不存在免疫排斥反应，患者无需长期服用免疫抑制药物。鉴于成熟肝细胞体外培养的限制性，将外源基因导入肝细胞较为因难，而利用干细胞则较为容易。只要宿主肝细胞生长的微环境良好，经过基因改造的肝脏干细胞或骨髓干细胞可望纠正肝脏代谢缺陷性疾病，这种基因修饰的干细胞自体移植的确显示了良好的应用前景。

目前，关于肝脏干细胞研究取得了很大进展，但由于有许多困难，肝脏干细胞还处于实验阶段。但不久后，其临床运用的前景将造福于广大肝病患者。

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