软骨干细胞

什么是软骨干细胞

软骨干细胞是指人耳中可发育为软骨的干细胞。该干细胞可用于面部器官骨折引发的整形。

软骨干细胞存在的依据

关节软骨组织是一个无血管、无神经的具有高度细胞外基质和细胞比的特殊组织，而且软骨细胞一直被认为是关节软骨中唯一存在的细胞类型。但是近年来一些研究证据提示软骨中除了软骨细胞外，还有于细胞存在。首先，关节软骨并不是均质性的，从关节表面到深层可以分为软骨表面、过渡带和深层区，每一层具有不同的生化特点和细胞表型。表层细胞呈现扁平椭圆，具有与关节表面平行的长突起，主要分泌表面蛋白多糖(surface zone proteoglycan pro-teoglycan 4)；移行带细胞呈圆形柱状排列，并且分泌软骨中间层蛋白 (cartilage intermediate layer protein,CILP)； 而深层细胞体积较大，硫酸软骨素排列与软骨表面垂直，主要表达X型胶原和碱性磷酸酶。关节软骨中这种不均质性对关节软骨中软骨细胞是不是唯一细胞的观念提出了挑战。其次，关节软骨是以外积性生长方式生长的为进一步提出软骨中存在干细胞奠定了基础。Castano最早通过显微镜对6~8周兔子的股骨滑车关节软骨厚度、细胞密度和细胞外基质等的研究发现，6周龄兔子关节表层的软骨细胞具有很强的增殖活性，而随着年龄的增加，兔子关节表层细胞密度降低，但软骨表层却有大量的细胞外基质沉积，这个发现提示软骨生长与外向性的生长方式密切相关。Hayes最终于2001年证实关节软骨是以外向性方式生长，并且关节软骨表面和移行带为外向性生长提供细胞来源。基于此，Hayes提出了关节表面细胞谱系假说：关节表面干细胞分裂成2个子代细胞，一个继续保持干细胞特点，另一个移行到过渡带并可以分化为终末细胞，由于关节软骨是外向性生长，移行区的细胞相对位置还是接近原始干细胞位置，即关节软骨表面。这是比较早提出软骨存在干细胞的报道。以上两方面的依据为研究软骨干细胞提供了理论基础。再者，临床研究证明单层扩增后的软骨细胞可以移植到软骨缺损处来修复软骨组织。

虽然具体修复机制还不明确，但是至少说明软骨具有一定潜能来修复受损组织，或许这种潜能与干细胞有关。以上理论基础和临床报道为以后软骨干细胞的研究提供了强有力的理论依据。

软骨干细胞研究发展

日本研究人员2011年8月8日在美国《国家科学院院刊》（PNAS）网络版上发表论文说，他们在人耳中发现了可发育为软骨的干细胞。

横滨市立大学教授谷口英树率领的研究小组，在对小耳症患者切除的耳软骨进行分析时发现，覆盖耳软骨的膜中存在一种特殊细胞，这一细胞具有发育为软骨等组织的干细胞性质。

研究人员成功在试管中将这种软骨干细胞培育为成熟软骨细胞，然后将其移植到实验鼠背部皮肤上，最后形成了软骨。这种再生软骨在实验鼠身上维持了约10个月。

研究小组认为，利用这一成果，今后在治疗鼻骨骨折、面部骨折等面部变形时，有望从患者耳中采集软骨干细胞，进行软骨细胞培养并移植到患者的腹部皮下脂肪，等软骨细胞发育成一定程度大小的软骨后，移植到患部。

软骨干细胞研究现状

1、关节软骨干细胞

Barbero等学者于2003年在人关节软骨细胞经过单层培养扩增去分化后是否具有多向分化能力以及这种能力与生长因子的关系的研究中发现，人软骨细胞可以形成细胞克隆，但是大部分细胞克隆不具有多向分化的能力，或者只能再分化为软骨细胞，只有小部分细胞(10%)可以多向诱导分化(成骨、成脂和成软骨)，并且这种分化能力明显受到细胞因子(转化生长因子β、纤维母细胞生长因子受体2等)的影响。Chen等研究表明从软骨中分离出直径<5um的细胞具有增殖能力并且能够分化为软骨细胞，因此他们推测软骨中存在干细胞性质的细胞。Barbero的研究结果从细胞克隆水平上揭示人关节软骨是一个具有高度细胞异质性的组织，并且部分软骨细胞经过单层培养后具有间充质干细胞的特点。Alsalameh于2004年采用干细胞标记物(CD105/CD166）共标记法来分析软骨细胞中是否具有干细胞存在，通过对细胞CD105/CD166共标记流式细胞术分析表明正常关节软骨细胞中具有CD105/CD166阳性的细胞约占3.49%，而且关节炎患者这种双阳性的细胞明显比正常者多。进而他们又采用免疫磁珠筛选法将具有CD105/CD166双阳性细胞筛选后进行多系诱导发现，这种双阳性的细胞可以诱导成骨、成脂和成软骨，研究表明正常软骨和关节炎患者软骨中均存在干细胞。同年，Fickert等采用于细胞标记物CD9、CD44、CD54、CD90、CD166中的任意三种对骨关节炎患者的软骨细胞进行三重荧光标记并进行流式分析及筛选，结果显示不同三种干细胞标记物的组合含量是不一样的(比如，CD9+/CD44+/CDI66+比例为12.2%±10%，CD9+/CD90+/CD166+比例为8.2%±10.4%，CD9+/CD44+/CD54+比例为2.5%±1.8%)，这种数量波动说明关节软骨细胞具有不同的细胞亚群，这与软骨非均质性是吻合的。同时通过CD9/CD90/CD166流式细胞分选并进行多向诱导发现，CD9+/CD90+/CD166+的细胞可以成骨、成脂和成软骨。Fickert通过三重干细胞标记物荧光流式分析表明关节炎患者关节软骨中存在干细胞。Notchl是调节干细胞增殖和分化的重要信号分子，因此，被认为是标记干细胞的标志物。Hiraoka通过对正常人关节软骨和关节炎患者Notchl流式以及免疫组化分析，结果表明正常人关节软骨和关节炎患者软骨中存在少量Notchl阳性细胞，再次证实关节软骨中存在干细胞。虽然以上学者通过不同的方法多角度证实了关节软骨中存在干细胞，但是他们并没有明确软骨干细胞的定位(软骨表层、移行带还是软骨深层）。Dowthwaite等分别提取出生7d的牛关节软骨不同层面软骨细胞并利用细胞对纤维粘附素粘附性的差异进行细胞筛选，发现软骨表面和移行区细胞与纤维粘附素更有粘附力，而深层细胞粘附力没有前二者强。流式细胞分析干细胞标志物Notchl的阳性率显示软骨表面细胞阳性率为86%，移行区和深层分别为10%和34%。通过对筛选细胞形成的细胞克隆大小和数量分析表明软骨表层细胞增殖能力明显比移行区和深层明显。结论证实软骨于细胞存在于关节表面。2007年Hattori采用流式分选和对牛关节软骨的表面区域蛋白(superficial zone protein）免疫印记的研究结果再次证实关节软骨表面存在干细胞。但是Hiraoka通过免疫组化分析人关节软骨Notchl的表达分布情况，并没有发现干细胞主要存在于关节表面的现象。Ustunel认为Notchl阳性的细胞主要分布在软骨近表面区域，但是在软骨深层也富有Notchl阳性细胞。这种不一致现象是否与物种、干细胞标记物类别有关还有待研究。虽然上述研究都证实软骨中存在干细胞，但是以上研究有一个共同的问题：不能排除周围组织污染所带进来的干细胞。为了明确关节软骨是否存在真正的干细胞（而不是周围组织污染所致），Thomemo通过琼脂糖三维培养系统证实关节软骨中确实存在干细胞。总之，以上研究已经很明确的表明关节软骨存在干细胞。

2、纤维软骨组织干细胞

椎间盘是纤维软骨的典型代表，椎间盘中干细胞的研究近来也成为热点。Risbud等通过对退变人椎间盘组织髓核和纤维环细胞的分离、筛选和鉴定，结果表明退变的纤维环和髓核中含有多向分化能力(成骨、成脂和成软骨)的干细胞，并且表达同骨髓间充质干细胞相似的表面标志物。Feng等从脊柱侧弯患者中分离、筛选未退变的纤维环，研究发现正常纤维环中也存在干细胞，不仅能够向骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化，还可以分化为神经细胞和内皮细胞。Blan-co等研究表明退变髓核中存在具有间充质干细胞性质的细胞，但是髓核中的这种干细胞不能诱导分化为脂肪细胞。以上研究在一定程度上表明椎间盘组织中存在干细胞，但是椎间盘中干细胞的具体性质还有待进一步明确。其次，由于外层纤维环有血管组织和其他组织，因此椎间盘组织中髓核和纤维环含有的干细胞是内在的还是外来的还不能明确。Henriks-son等采用BrdU体内标记技术研究椎间盘中干细胞的来源，结果表明临近骨骺板的软骨膜可能是干细胞池，里面的干细胞朝向纤维环和髓核迁移。综上所述椎间盘中是否真正存在干细胞还有待深入研究。

3、弹性软骨-耳软骨干细胞的研究

目前关于耳软骨干细胞的研究多集中在耳软骨膜上。

软骨组织一直以来被认为是缺少自我修复能力的组织，软骨的缺损经常会导致关节炎的发生。近几年来，随着生物技术、组织工程技术、材料与分子生物学的发展，人们在软骨的基础实验研究方面取得了很多进展，为成功治疗软骨病变带来了更多、更好的方案。尤其是软骨组织中干细胞的发现和研究，为从不同角度治疗软骨病变开辟了新的道路。

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