间充质干细胞注射液治疗心肌梗死的现状与展望

项目名称:间充质干细胞注射液治疗心肌梗死的现状与展望
研究医院/机构:中国医学科学院阜外医院
领头人/团队:杨跃进
团队联系方式:010-88322674

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项目特点及应用方向:

主要研究方向：

1、应用基础研究及临床前研究

1)心室重构和心衰的机制及防治研究

2)存活心肌的识别检测和干预研究

3)冠脉和心肌无再流的机制及防治研究

4)干细胞分化和他汀改良梗死心肌微环境提高移植疗效的研究

2、临床研究和转化应用

1)PCI微创化（TRI）和优化（光学相干断层成像 OCT）

2)强化他汀治疗急性心肌梗死（AMI）的研究

3)中药用于AMI预防无再流的研究

4)干细胞新药“间充质干细胞心梗注射液”治疗AMI的随机安慰剂对照多中心临床试验

主要内容

宋雷 综述 杨跃进 审校（中国医学科学院 阜外心血管病研究所  中国协和医科大学阜外心血管病医院，北京)

StatusandFutureProspectsofMesenchymalStemCellBasedTherapyforMyocardialInfarction

摘要：间充质干细胞存在于骨髓、脂肪等多种成熟组织，易于体外分离培养。很多临床前及临床研究已经证实其可以通过分化为心肌样细胞、促血管生成、旁分泌等作用参与心肌梗死后组织修复，改善心脏功能。间充质干细胞是理想的心肌再生治疗的细胞来源，现就相关领域研究现状及进展做一综述。

关键词：心肌梗死；间充质干细胞

心肌梗死后细胞不可逆死亡及瘢痕组织替代是患者心功能进行性恶化的重要原因。随着干细胞技术的发展，用细胞移植的方法修复坏死或功能异常的心肌成为研究热点。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)作为移植的供体细胞日益引起人们关注。

本文就MSCs移植治疗心肌梗死相关领域研究的现状及进展综述如下。

1  间充质干细胞的生物学特性及分离培养

MSCs是上世纪70年代Friedenstein首次从骨髓分离的一种具有多向分化济能的纺锤状、成纤维细胞样细胞，具有自我更新、克降增殖和多向分化能力，MSCs可以从骨髓、脂肪、羊膜或牙组织中提取，但骨髓MSCs提取方便故应用最广。MSCs没有自身特异性的表面标志，但CD90、H2(CD105)、SH3(CD73)、SH4等黏附分子阳性，CD34、CD45等造血干细胞标志物阴性。MSCs表面HLA-II荆抗原水平较低，故具有独特的免疫学特性，如抑制T/B淋巴细胞增生，抑制单核细胞向树突状细胞分化，及诱导非特异性免疫抑制的作用。因此同种异体MSCs移植并不引起排界反应，有利于临床应用，使急性心肌梗死患者也能获得细胞移植机会。

MSCs一般从骨简单个核细胞(bonemarrowde­rivedmononuclearcells,RM-MNCs)中分离，其易贴啖的特件可以区别于造血细胞。但这种分离方法难以避免造血干细胞污染及细胞的不均一性，单个MSC的分化能力差异较大，应用单克隆抗体的分离方法也不能单纯分离出高分化能力的细胞[4]。MSCs的生长分化能力受培养瓶的表面特性、培养液中的氮含量、血清浓度、细胞密度、保存方式等影响，分离培养方法间的差异造成MSCs的高度异质性。因此国际细胞治疗学会(lntP.mationalSocietyforCdlularTherapy)在2006年提出确定MSCs的三个标准：

（1)在标准培养基下贴壁；（2）表达CD105、CD73和CD90，且不表达CD45、CD34、CD14或CD1lb等造血细胞标志物；（3）体外诱导下能够分化为成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞。

2 移植间充质干细胞的去向和命运

移植MSCs在宿主体内的去向一直是研究者关心的问题。动物试验显示无心脏损伤情况下，MSCs移植细胞在胃肠道、肾脏、肺脏、肝脏、胸腺和皮肤组织均有分布，大部分仍返回骨髓，但在心肌梗死时MSCs多迁移至性化区域。Barbash等的研究发现心肌梗死大鼠静脉注射MSCs,1周内可在心肌梗死区域找到标记细胞，而对照组大部分标记细胞位千骨髓，远离梗死区域的心肌组织未发现明显移梢细胞。MSCs向梗死区域的迁移可能与局部趋化因子表达增加有关，参与这一过程的物质目前还未明确。粒细胞集落刺激因子是已知的动员因子之一，可以促进MSCs向梗死区域的移行。其它与诱导MSCs迁移有关的因子还包括基质细胞衍生因子－1(stromalcellderiv叫factor-1,SDF­l)及其配体CXCR419]、基质金属蛋白酶(matrixmetal­loproteinase,MMP)、单核细胞诱导蛋白－1(monocytechemoattractantprotein-I,MCP-1)与趋化因子受体CCR2[10]等。通过逆转录病毒转染SDF-1到小鼠心脏可以促进心肌梗死后骨髓干细胞的募集，但缺血性心肌病患者骨髓干细胞对SDF-1的反应减弱，限制了此类患者细胞移植治疗的价值。

心肌梗死时局部缺血缺氧，微环境恶劣(pH值下降、渗透压升高、代谢产物堆积），不利于移植细胞生存。绝大部分移棺细胞死亡发生在24-48h内，Mull-er-Ehmscn等的研究显示植入细胞在24h内死亡超过76%，只有15％的细胞存活超过12周。移植细胞死亡的机制包括心肌细胞的渗油或血管系统的冲刷；移植细胞对缺血缺氧耐受性低；炎症反应及缺乏基质支持造成的凋亡(Anoikis，失巢凋亡现象）等。因此采取有针对性的细胞保护措施至关重要：针对移植细胞对缺氧耐受性低转染增强细胞活性的因子，如丝氨酸／苏氨酸蛋自激酶(Akt)、胰岛素样生长因子(in­sulin-likegrowthfactor,IGF)、肝细胞生长因子(hepato­cytegrowthfactor,HGF)；针对血供不足，转染血忤内皮细胞生成因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)，应用促红细胞牛成素与内皮祖细胞联合移植；针对炎症反应及细胞凋亡，加用热休克蛋白、自由基清除剂、激素等。上述方法均有一定效果，但单纯针对一种途径的作用往往有限，同时针对多种途径的鸡尾酒疗法疗效可能更明显。他汀类药物及某些中药，可同时针对多种机制作用，对移植细胞有特殊的保护效应。

3 间充质干细胞向心肌样细胞的分化

1999年Makino等通过5－氮杂胞昔(5-azacytidine,5-aza)诱导鼠MSCs分化出具有心肌细胞形态和电机械特征的细胞，形成肌管样结构，能自发搏动，并表达肌球蛋白、＂肌动蛋白、心肌转录因子4(GATA4)、肌细胞增强因子2(muscleenhancerfactor2,MEF-2)、心肵发合早期转录因子(NKx2.5)、心钠肤等心肌细胞特异标忐物，为MSCs应用于心肌再生治疗提供了理论基础。此后的一系列研究也相继发现MSCs可以定位于心肌损伤的部位并分化为心肌样细胞。然而，由于细胞融合的干扰，MSCs是否能真正分化为有功能的心肌细胞至今仍存在争论。

5－氮杂胞昔潜在的遗传毒性限制了其临床应用，其它可能的诱导剂包括抗坏血酸气催产素等。研究显示MSCs可根据局部微环境不同表达不同的细胞表型，如在瘢痕组织表达平滑肌的表型，在血忤组织表达内皮细胞表羽，在心肌微环境下表达心肌细胞表型。Rangappa的研究发现将人MSCs与心肌细胞共同培养，可诱导其向心肌细胞分化，表达肌球蛋白重链、p肌动蛋白、肌钙蛋白等特异标忐物，MSCs之间及其与固有心肌细胞间还通过缝隙连接形成细胞－细胞偶联。然而用滤除心肌细胞后的培养基孵化时，只观察到B肌动蛋白的表达，可见直接的细胞接触对诱导分化十分必要。然而，近期发表的一项研究将MSCs与新生小鼠心肌细胞在半透膜两侧培养，MSCs也可分化为心肌样细胞并表达特征性的标志物，对细胞直接接触诱导提出质疑，进一步理解细胞间信号传导机制将有助于改进或发现新的心肌再生治疗手段。

4 临床前研究

随着体外试验发现MSCs可以分化为心肌样细胞，相应的体内分化研究也在本世纪初逐渐开展。2001年美同的Orlic等首先在Nature发表文章，将从雄性小鼠骨髓中提取的Lin-/c-Kit+细胞（包括MSCs和造血干细胞）注入雌性小鼠心肌梗死区域．9d后带有Y染色体和荧光标记的细胞占梗死区域的68%，包括心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。其中心肌细胞表达MEF-2、GATA-4等心肌特异标志物，与对照组相比左室舒张未压降低36%。Shake等在猪心肌梗处摸型中也有类似发现，心肌内注射自体MSCs2周后可见心肌标志物表达，伴有心室收缩功能改善，但未发现肌节组织形成。而Tang等在免疫缺陷小鼠心肌内注射人MSCs，不仅观察到肌钙蛋白、a辅肌动蛋白和受磷蛋白表达，而且发现了肌节组织形成的迹象。Amado等在猪心肌梗死3d后心肌内注射同种异体MSCs，显示梗死面积减小，左室功能改善，且未引起排斥性的炎症反应，显示了同种异体移桢的可行性。

目前MSCs移植途径有以下5种：（1）通过开胸手术经心外膜注入；（2）通过心腔内导忤经心内膜注入；(3)冠状动脉内注射；（4）通过冠状静脉系统注入；（5)外周静脉注射。最佳的输送途径尚不清楚，但原则是最小创伤与最大获益间的平衡。静脉注射的MSCs很大部分存留在肺组织内，限制了十细胞的治疗效应。侵人性的输送途径虽然增大手术风险，但安全件已得到证实，且随着专用注射装置的应用风险还会进一步降低。目前一系列大型动物（如羊、狗和猪）模型的研究，已经证实在梗化区域内注射MSCA是安全可行的，心肌内汴射104~108数扭级的MSCs不会导致明显的免疫或毒性反应。但Vulliet等报道犬冠脉内注入1~5x106MSCs可造成继发的ST-T改变和微梗死，可能与注入的MSCs细胞体积较大(18-20µm)有关，其它采用冠脉内注射的MSCs研究未发现类似现象。

5 临床研究

与以往基础研究不同，干细胞移植应用到临床的速度前所未有。但早期多采用造血干细胞或BM­MNCs。TOPCARE-AMI试验是最早的临床研究之上，急性心肌梗死后(4.3士l.5)天的患者冠脉内注射自体CD34+/CD45＋造血干细胞，随访4月发现左室射血分数(leftventricularejectionfraction,LVEF)从(51.6土9.6)％提高到(601士8.6)%，收缩末期心室容积下降，梗死区域室壁运动改苦，没有发现恶性心律失常或明显炎件反应。Pein等报道在心脏电机械标测系统指引下心内膜注射n体BM-MNCs治疗缺血性心力哀竭，包括14例患者7例对照，随访2月时治疗组的心肌可逆性缺损明显减少，左室整体收缩功能明显提商，4月时治疗组LVEF从20％提杆到29%，该研究也是第一个将骨髓下细胞移植用于心力哀竭治疗的临床研究。

2004年发表的BOOST试验是首个随机对照临床研究，梗死相关血管介入术后的60例患者随机分为常规治疗组和冠脉内骨髓下细胞移植组。细胞移植组的LVEF改善在6个月时有显著性，而在18个月时无明显差别，心律失常发生率及病死率无明显差异。显示骨髓干细胞移植早期可以加速左室收缩功能的改善，但并未显现出远期获益。不过，最近发表的REPAIR-AMI研究报道了令人鼓舞的结果，该研究是迄今为止最大规模的随机双盲对照研究，入选204例介入治疗成功的患者，再泄汴治疗成功后3~7d随机冠脉内注射骨骼来源干细胞或安慰剂，随访1年显示骨随干细胞移植组患者病死率、再血管化率、住院率及再次梗死率均明显低于安慰剂对照。

首个将MSCs应用千临床的随机对照研究由Chen等在2004年报道，该研究入选了69例急性ST抬高型心肌梗死后12h内再灌注治疗的患者，随机分为冠脉内汴射MSCs和对照组，随访6个月显示室壁运动及LVEF改善，心肌灌注缺损缩小，2组患者心律失常发生率及病死率无并别。后续分析显示患者的获益主要来源于移植MSCs的血管生成作用及旁分泌功能，而非MSCs向心肌细胞的分化。

以往临床研究巳经证实了干细胞移桢治疗的安全性及其改善心脏功能的初步作用，但主要研究均针对未纯化的骨髓干细胞，单纯采用MSCs者较少。目前一系列大规模的随机对照临床研究正在进行中，相信这些研究结果的逐渐发表会对MSCs的临床应用起到推动作用。

6 间充质干细胞参与组织修复的机制

MSCs作用机制复杂，一般认为多种途径同时存在，各种机制间相互协同，共同参与组织修复：

6.1 间充质干细胞向心肌样细胞分化

MSf.s是否能分化为功能性的心肌细胞仍存在争议，细胞融合可能起一定作用。但有研究通过染色体组型分析确认细胞融合在体内罕见，对组织修复或功能无明显影响i29]。但即使移植细胞分化为心肌细胞样其数话仍远远少于正常心肌细胞。如果心功能的改善确实可信，必然打儿它机制共同作用。

6.2 促进血管形成

MSCs不仅能分化为心肌样细胞，而且能分化为血管平滑肌细胞、内皮细胞或血管外膜细胞[I)，多项研究均显示移植区域血管密度增加，局部血忤内皮生长因子(VEGF)表达升高，灌注明显改善。

6.3 旁分泌功能

MSCs可以分泌一系列细胞因子，如与血管生成有关的细胞因子VEGF、成纤维细胞生长因子、转化生长因子－B｀促血忏生成素、胎盘生长因子等；各种趋化因子如干细胞因子(stemcellfactor,SCF)、MCP-1、SDF-1等；炎症因子如肿熘坏死因子a、IL-1、IL-o等。这些细胞因子具有促进血管或心肌细胞生成，抑制凋亡，抑制免疫反应，促进千细胞募集及迁移等多种作用fll]，共同参与组织修复。

6.4促进内源性干细胞的作用

MSCs对维待干细胞微环境稳定起重要作用，可以促进内源性干细胞的活化和迁移。

7 间充质干细胞移植存在的问题和展望

目前MSCs治疗心肌梗死过程中仍有很多重要问匙悬而未决，今后需要在以下方面继续研究：明确MSCs移棺的最佳策略，优化移植细胞的数量、途径、移植时机及示踪方法，避免化学诱导剂的应用；提高移植细胞对缺血缺氧的耐受性，抑制细胞凋亡，改善移植的效率；明确细胞间的信号传导及干细胞分化迁移的机制；在更长的时间段内观察远期不良反应。在MSCs移植真正投入临床应用前尚需进行更大规模的随机对照临床试验，以进一步验证其安全性及有效性。总之，由于MSCs具有伦理学、免疫学上的优越性，取材及培养扩增相对简单，是理想的移植细胞来源之一，有广阔的临床应用前景。

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